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　摘要：目的

　建立兔子体内不同组织中利福平分析方法建立及含量测定。研究兔子腰椎皮下埋植给药方式的情况下，三种药物(原料药、处方 6、处方 9)在兔子体内肝脏、兔肺脏部位、兔脾脏部位的利福平浓度和回收率和精密度。

　方法

　以THERMAL BDS C 18

　column (5µm, 250 mm×4.6 mm)为色谱柱，流动相为乙腈-甲醇-0.01mol/l 磷酸二氢钾-1mol/l 柠檬酸=40:30:26:4（v/v）；流速 1.0 mL/min，柱温 35℃，紫外检测波长 333nm，进样量 20μL。36 只实验用大白兔随机进入实验组，实验组分为 A、B、C 三组，A 组为腰椎皮下埋植原料药，B 组为腰椎皮下埋植处方 6，C 组为腰椎皮下埋植处方 9。用高效液相色谱法检测各天数后的血浆药物浓度、腰大肌部位药物浓度、腰椎体部位药物浓度。

　结果

　利福平在0.01-5.0µg/mL 的肝脏浓度范围内线性关系良好(r=0.9999)，回收率达 85%以上，日内变异系数均小于 10%；利福平在 0.05-10.0 µg/mL 的肺脏部位和脾脏部位浓度范围内线性关系良好(前者 r=0.9999，后者 r=0.9995)，前者回收率达 88%以上，日内日间变异系数均小于 10%；后者回收率达 85%以上，日内日间变异系数均小于 10%。对于血浆中利福平的浓度基本检测不到，腰大肌和腰椎体都有利福平的蓄积。

　结论

　本研究建立了一种兔子肝脏、肺脏和脾脏组织中利福平简便、快速、灵敏准确的高效液相色谱（HPLC）检测方法，并将该方法应用在利福平在家兔体内的药物动力学研究。

　关键词

　利福平

　兔肝脏

　兔肺脏

　兔脾脏

　高效液相色谱法

　 Abstract: Objective

　establish methods rabbits rifampicin different organizations and assaying. Case study of rabbit lumbar implants administration of three drugs (bulk drugs, prescription 6, prescription 9) in vivo rabbit liver, rabbit lung area, rabbit spleen parts of rifampicin concentration and recovery and precision. Methods THERMAL BDS C18 column (5μm, 250 mm × 4.6 mm) for the column with a mobile phase of acetonitrile - methanol -0.01mol / l potassium dihydrogen phosphate -1mol / l of citric acid = 40: 30: 26: 4 (v / v); the flow rate of 1.0 mL / min, the column temperature was 35 ℃, detection wavelength 333nm, the injection volume was 20μL. 36 experimental rabbits were randomly assigned to the experimental group, the experimental group was divided into A, B, C three groups, A group of lumbar implants API, group B prescription 6 lumbar implants, Group C lumbar implants Prescription 9. Plasma drug concentration after a few days each by high performance liquid chromatography, psoas site drug concentration, drug concentration lumbar portion. Results rifampicin concentrations in the liver linear relationship 0.01-5.0μg / mL of good (r = 0.9999), the recovery rate of 85%. Within less than 10% coefficient of variation; rifampicin 0.05-10.0 μg / mL site location and spleen lung concentration range a good linear relationship (former r = 0.9999, which is r = 0.9995), the former recovery rate of 88%, intraday day coefficients of variation were less than 10%; the latter recovery rate of 85% above intra-day variations were less than 10%. The concentration in plasma rifampicin substantially less than the psoas muscle and lumbar rifampicin has accumulated. Conclusion This study established a rabbit liver, lung and spleen tissues rifampicin is simple, rapid, sensitive and accurate high performance liquid chromatography (HPLC) detection method, and the method used in the drug rifampicin in rabbits Kinetics.

　 Keywords ：

　rifampicin ； liver ； lung ； spleen ；

　HPLC

　 1 引言 结核病是目前感染性疾病中的一号杀手。1992 年世界卫生组织正式结核病进入了“全球紧急状态”[1] 。当今全世界大概有 1/3 的人被结核菌感染。染病者的数量高达 1.7 亿，感染和发病比率约为 1/10，每年死亡人数将近三百万。高的治疗费用，低的治愈率，高的死亡率等等因素，都可以得出得了结核病后这方面的不好之处。对于患者自身而言，除了健康受到损害，生命质量受到影响等等外，其他精神反面也受到了很大的打压。对于患者的家庭，他们的精神与经济两方面都会受到沉重的压力影响，从而使该方面的社会负担问题加重。现关于结核病方面的已成为全球性的严峻难题，中国感染者数量非常多，位列世界第二位。目前人们更加重视自身的健康问题。所以人们对抗结核病方面的措施做了很多，改善了很多。世界各国患病率与死亡率曾因卫生状况的改善和抗结核病药物的不断发展大幅度的下降。但是因为下面的原因，结核病在控制方面变得更难：由于大量抗生素的使用使得各种病菌产生耐药性；与艾滋病一起使人类同时感染两种病菌；贫困地区的生活水平差，防范意识不少，人口又增加过快，一旦干扰就会出现群体感染。因此，在如今提倡高质量生活减少疾病的现代化社会加大对抗结核病药物的研究是至关重要的。

　1944 年，医学研究者首次发现了链霉素，并实验验证了其抗结核的作用。不久以后许多同类药物被研究出来，比如异烟肼等。可以将现今的抗结核药物分为：①具备抑菌作用的抗结核药物：环丝氨酸（CS）、乙胺丁醇（EMB）、对氨基水杨酸（PAS）；②具备杀菌作用的药物：利福平（利福平）、异烟肼（INH）、吡嗪酰胺（PZA）、卷曲霉素（KM）、卡拉霉素（CPM）、链霉素（SM）；具备一定杀菌能力的药物：氧氟沙星（OFLX）、左氧氟沙星（LVFX）等。临床上将利福平、异烟肼、链霉素等定义为一线抗痨药。1978 年举行了全国结核病研讨会，会议上提出了“早期、规律、全程、适量、联用”的结核病治疗基本准则。[2,3]

　药物在开发的时候非常复杂，也需要非常长的时间对其进行研究，一般从某一药物出现后到被应用，大概需要十年的时间，花费的钱也不计其数，高达 10亿。由统计可知，利福平被研发至今已经有三十年的历史，在此期间有高达 1200

　多种新的药物出现并被使用，在众多的药物之中竟然没有用来对付结核病的。一部分原因是因为该类药物开发起来与其他药物相比相对困难，另一部分原因是因为结核病基本不会出现在发达国家，非发达国家的科学水平低下，对药物研制投入较少，很难研制出该类药物。我们可以预见在临时使用上还将会有较长的一段时间缺少新型强有力的抗结核药物。以往的药物（如利福平）在给药的时候会有下面的缺陷：①给药时间长，现在在进行该病的治疗时一般需要花很长的时间，一般都需要半年以上的时间，甚至高达 1 年到 1 年半以上。②该药在患者体内起作用的时间不够长，这就要求经常服用药物，而且药物的浓度是否能够达到治疗的目的目前还不够明确。③长期服用会对肝、肾功能发生损伤，引起并发症；④ 对该病的质量需要花很长的时间，患者并不能服从治疗，而且长期用药会产生耐药性。上世纪 80 年代以来，科学家们对抗结核药物的载体进行了大量的研究，而且很有可能克服以上传统药物的缺点 [6] 。

　利福平虽然起到抗结核的作用，但患者在服用它时，会产生许多的不适症状，而最主要的是肝脏毒性，同时服用异烟肼的时候不适症状更加严重，最严重的后果就是急性肝坏死。尽管如此，目前对利福平副作用的研究还仅仅停留在表面，并没有对其做深入的研究。[7] 利福平分析方法研究，需要对其进行改进。综合文献，利福平分析方法并不少见，有化学发光法、高效液相色谱法等。在大部分文献报道中，利福平的高效液相色谱法技术已经较为成熟。

　本研究对兔子脊柱皮下埋植给药后血清中利福平体内高效液相色谱方法含量测定进行研究，最终建立高效液相色谱检测方法。

　2 材料与方法 2.1 实验用试剂、药品、仪器及动物 2.1.1 试剂

　乙腈(色谱纯)，杭州市米克化工仪器有限公司；甲醇(色谱纯)，杭州市米克化工仪器有限公司；磷酸二氢钾(分析纯)，国药集团化学试剂有限公司；柠檬酸(分析纯)，国药集团化学试剂有限公司；乙酸乙酯(分析纯)，国药集团化学试剂有限公司；三氯乙酸(分析纯)，杭州高晶精细化工有限公司；二氯甲烷(分析纯)，杭州高晶精细化工有限公司；正己烷(分析纯)，国药集团化学试剂有限公司；水(本实验用到的水均为超纯水)；速眠新注射液；氯胺酮注射液

　2.1.2 药品

　利福平标准品(中国药品生物制品检定所)；利福平原料药(客户提供)；处方6(客户提供)；处方 9(客户提供)；

　 2.1.3 仪器

　shimadzu 20AT 高效液相色谱系统(日本岛津)；色谱柱为 THERMAL BDS C 18

　column (5µm, 250 mm×4.6 mm)；浙江大学智达 N2000 色谱工作站；Hettich Mikro 22R 超高速低温离心机(德国)；YKH-型涡旋混合器(上海精科实业有限公司)；BS200S-WEI 电子天平；KQ-25OB 型超声波仪(昆山超声仪器有限公司)；氮吹仪(上海极恒实业有限公司)；WMZK-01 恒温水浴锅；抽滤装置(上海富雪生物科技有限公司)；SHBZ- III A 型循环水真空泵；0.45µm 微孔滤膜(上海新亚净化器件厂)；

　10ml 具塞离心管，1.5ml 小离心管，尖底玻璃离心管；试管架；量筒；Thmermo微量移液枪；匀浆器；玻璃棒；烧杯；实验用兔笼；实验用剪骨器；实验用手术板；动物用手术装置 2.1.4 实验动物

　实验用大白兔(由浙江省实验动物中心提供)，体重 2.2kg~2.5kg/只，雌雄兼用。

　 2.2 试验方法

　2.2.1 实验动物分组与给药

　取实验用大白兔 46 只，体重 2.2-2.5kg/只，雌雄不限，分笼饲养。随机取1 只用于空白方法组，其余 45 只随机进入实验组。实验组共分为 A、B、C 三组，每组 15 只。A 组为腰椎皮下埋植原料药，B 组为腰椎皮下埋植处方 6，C 组为腰椎皮下埋植处方 9。各组兔称重后，将实验兔左侧腰背部去毛备皮，常规皮肤消毒，右侧卧固定在手术板上，用速眠新麻醉 0.5ml/kg+氯胺酮 0.1ml/kg 麻醉，等麻醉起效后，切开浅层肌肉，沿腰椎植入 A、B、C 组药物，消毒，缝合，包扎固定。后将兔子按 1d、7d、14d、28d、56d 分笼饲养。术后饲养，观察及检测：定期观察动物活动及进食情况，伤口愈合情况。饲养要保证兔子存活，环境符合，无影响实验情况发生。

　在各天数到后，进行耳缘静脉取血，在最后时间点还未到时，需要取血，不得处死，要使兔子存活。在取完血，要取组织时，处死，后取腰大肌，腰椎骨进行检测。

　对于空白组的处理：在适当的时候取血，取腰大肌，腰椎骨。除了不植入药

　物，其它都同实验组。

　2.2.2 样品处理

　2.2.2.1 兔肝脏的样品与处理

　①肝脏组织匀浆液的制备：将肝脏组织用镊子取出，而后剪碎细微，搅拌，取其重量与水体积比例为 1:1 适量于匀浆器匀浆均匀，易被移液枪准确取出即可。

　②取上述 0.6ml 肝脏组织匀浆液放在 10ml 有塞子的离心管当中，振荡离心管使其混合均匀。接着滴入乙酸乙酯 3ml，涡旋 5min 分钟，在 6000r/min 转速的条件下离心 5 分钟。取出全部上层有机相并将其放在具有尖头底部的离心管当中。向萃取完第一次后的 10ml 有塞子的离心管中滴入 2ml 乙酸乙酯重复萃取一次。接下来在具有尖头底部的离心管当中将两次萃取的有机相进行混合，在 45度的水中用氮气流吹干离心管。后留在尖底玻璃离心管中的残留物用 0.2ml 流动相再一次溶解，涡旋振荡器混合 1 分钟。再把其放入试管架上，把此带有处理过的尖底玻璃离心管放到超声仪中进行 15 分钟的处理。使离心管内的残留物与流动相充分混匀。后将其移入 1.5ml 的小的离心管内，后再其滴放 0.2ml 正己烷取出脂肪。于涡旋振荡器漩涡 1 分钟，将小离心管置于离心机，在 18000 转/分钟的转速的条件下离心 5 分钟后。吸取上清液 20µl 进高效液相色谱系统分析。

　2.2.2.2 兔肺脏组织的样品与处理

　①肺脏组织匀浆液的制备：将肺脏组织用镊子取出，而后剪碎细微，搅拌，取其重量与水体积比例为 1:1 适量于匀浆器匀浆均匀，易被移液枪准确取出即可。

　②取上述 0.6ml 肺脏组织匀浆液放在 10ml 有塞子的离心管当中，振荡离心管使其混合均匀。接着滴入乙酸乙酯 3ml，涡旋 5min 分钟，在 6000r/min 转速的条件下离心 5 分钟。取出全部上层有机相并将其放在具有尖头底部的离心管当中。向萃取完第一次后的 10ml 有塞子的离心管中滴入 2ml 乙酸乙酯重复萃取一次。接下来在具有尖头底部的离心管当中将两次萃取的有机相进行混合，在 45度的水中用氮气流吹干离心管。后留在尖底玻璃离心管中的残留物用 0.2ml 流动相再一次溶解，涡旋振荡器混合 1 分钟。再把其放入试管架上，把此带有处理过的尖底玻璃离心管放到超声仪中进行 15 分钟的处理。使离心管内的残留物与流动相充分混匀。后将其移入 1.5ml 的小的离心管内，后再其滴放 0.2ml 正己烷取出脂肪。于涡旋振荡器漩涡 1 分钟，将小离心管置于离心机，在 18000 转/分钟的转速的条件下离心 5 分钟后。吸取上清液 20µl 进高效液相色谱系统分析。

　2.2.2.3 兔脾脏组织的样品与处理

　①脾脏组织匀浆液的制备：将脾脏组织用镊子取出，而后剪碎细微，搅拌，

　取其重量与水体积比例为 1:1 适量于匀浆器匀浆均匀，易被移液枪准确取出即可。

　②取上述 0.6ml 脾脏组织匀浆液放在 10ml 有塞子的离心管当中，振荡离心管使其混合均匀。接着滴入乙酸乙酯 3ml，涡旋 5min 分钟，在 6000r/min 转速...

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